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PCB 蛋白循环反应仪

供应数量:783

发布日期:2019/3/26

有效日期:2019/9/26

原 产 地:北京

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1.蛋白质免疫法
蛋白质是细胞里重要的组份并且它们的活性决定
细胞的功能,所以在生物学研究和临床检测中蛋白质检测是一项必不可少的工作。并且蛋白质检测在研究疾病机理和临床诊断上也发挥重要的作用。蛋白质检测基于免疫法,采用抗体和抗原之间的免疫反应,利用这一原理可以采用不同的实验方法,然而在这些实验方法存在着各自优缺点。
A。酶联免疫吸附测定

ELISA是蛋白检测中常见的一种方法,被称为酶免疫法。在1970年早期时候酶联免疫吸附测定已经取代了放射免疫检测法。ELISA方法依靠合适的抗体和样品的复杂程度,并且这些实验基于微孔板上完成。
(1)ELISA直接法

ELISA直接法是一种抗原被固定在一种基质上,然后可以被一种酶标记抗体所识别。也可以是一种抗体被固定在基质上,去识别被标记的抗原。zui后通过加入酶的底物产生信号进行检测。

直接法有两大优势:

快速,仅仅只需两步

操作步骤少,误差小。



(2)ELISA间接法

ELISA间接法中,抗原被包被在微孔板中,首先加入一抗与抗原结合,然后再加入酶标二抗与一抗结合。


 

间接法优势:

与酶标一抗检测方法相比,灵敏性增强

灵活性,这种带标记的二抗都可以用来检测一抗。

 

(3)ELISA三明治法

三明治法是使用zui多的一种方法。它需要两种抗体,并且两种抗体所识别的抗原靶位不能相同。一种被用来固定在基质上的抗体称之为捕获式抗体,另外一种需加在溶液中去识别抗原,称之为检测抗体。如果检测抗体上带有酶标记物,这种称之为ELISA直接三明治法。如果用带标记二抗去识别未标记的检测抗体,这种检测方法称之为ELISA间接三明治法。
 

ELISA三明治法优势:

1.高特异性,两种抗体去结合抗原

2.高灵敏性,采用了直接法和间接法。

(4)ELISA竞争法

该方法可以检测样品中抗原的浓度,这也被称为ELISA抑制法。这种方法可用在一种抗体只能识别一种抗原或者抗原分子量非常小,例如,一种半抗原,被能被两种抗体同时结合。

该方法基于ELISA直接法,间接法和三明治法,一种ELISA竞争法实验流程如下:首先捕获抗体被包被微孔板上,封闭之后,加入一定量带标记竞争性抗原,作为对照组,在另外一组,加入带标记的抗原和未带标记的抗原,让其同时竞争捕获抗体。如果未带标记的抗原浓度较高则产生的信号将低于对照组。相反,如果未带标记抗原浓度含量低,则产生的信号会略低于对照组。因此,ELISA竞争法通过检测信号强弱比较检测抗原浓度。

B。蛋白免疫印记

在蛋白质检测中蛋白免疫印记法是zui常见的方法。它可以和凝胶电泳结合对蛋白质抗原特征进行检测。例如,检测样品中抗原的分子量及含量。
 

标准检测流程包括:先通过sds凝胶电泳分离蛋白,再通过转移把蛋白转移制膜上,zui后通过特异性抗体检测信号。

C.蛋白质芯片

蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术,可用于蛋白质表达谱分析,研究蛋白质与蛋白质的相互作用,甚至DNA-蛋白质、RNA-蛋白质的相互作用,筛选药物作用的蛋白靶点等。蛋白芯片技术的研究对象是蛋白质,其原理是对固相载体进行特殊的化学处理,再将已知的蛋白分子产物固定其上(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等),根据这些生物分子的特性,捕获能与之特异性结合的待测蛋白(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等),经洗涤、纯化,再进行确认和生化分析;它为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的,它具有以下优点:

⒈ 直接用粗生物样品(血清、尿、体液)进行分析

⒉ 同时快速发现多个生物标记物

⒊ 小量样品

⒋ 高通量的验证能力

⒌ 发现低丰度蛋白质

⒍ 测定疏水蛋白质: 与“双相电泳加飞行质谱”相比,除了有相似功能外,并可增加测定疏水蛋白质

⒎ 在同一系统中集发现和检测为一体 特异性高 利用单克隆抗体芯片,可鉴定未知抗原/蛋白质,以减少测定蛋白质序列的工作量。

8。可以定量 利用单克隆抗体芯片,由于结合至芯片上的抗体是定量的,故可以测定抗原量,但一般飞行质谱不用于定量分析。

9。功能广  I。 利用单克隆抗体芯片,可替代 Western Blot,Ⅱ。 利用单克隆抗体芯片,可互补流式细胞仪不足的功能,如将细胞溶解,可测定细胞内的抗原,而且灵敏度远高于流式细胞仪)。

 

D.穿流法

穿流法由于简单快速被广泛用在诊断实验中。此方法是将一种含有分析的样品直接加到一种已经包被好抗体或抗原的具有多孔渗透性的膜介质上,通过膜介质下的吸水性材料将加入的液体从膜介质上吸走,zui后加入用标记的抗体或抗原进行显色测定。穿流法除了用应用软件精确分析外,还适用于快速检测分析。
2.蛋白质循环反映技术

 

A.蛋白质循环反应技术简介

蛋白质循环反应仪采用的是一种往返的过滤方式从而达到快速高效的检测蛋白技术。该方法中所加的抗体溶液可以多次穿过固定在多孔介质,每一次抗体溶液透过多孔载体形式类似与过滤的方式。每一次抗体溶液透过多孔介质过程时,溶液中的抗体可以与介质上的抗原发生特异性结合。该过程只需几次循环周期,就可以完成抗体和抗原的结合反应。 

B.蛋白质反应循环仪特点

(1)灵敏度增强

PCB关键优势是增强灵敏度。

(2)加快实验

在使用PCB技术过程中,每一次周期里溶液通过多孔介质仅需几秒中;并且我们发现在进行10个周期后达到zui大结合,因此,PCB方法可以实现快速仅需几分钟完成整个实验操作。 

快速实验操作可以在程序中设置,快速实验模式采用对应的程序设置如对应的诊断应用程序

(3)实验方法多样性

ELISA的实验操作方法都可以在PCB上都可以实现并且实验速度加快,灵敏度增强。

(4)直接用粗生物样品(血清、尿、体液)进行分析

 

C.蛋白质循环技术与ELISA比较
 

PCB与ELISA比较

 

PCB

ELISA

速度

快速,几分钟

几小时

灵敏度

多样分析

困难

定量

自动化

D。蛋白质循环反应技术原理

抗体和抗原相互之间的作用是免疫检测中关键因素。在众多的免疫检测方法中(包括PCB),基本上抗体或抗原被固定在固体基质上,如NC膜或者微孔板,并且抗体和抗原在溶液中发生特异性吸附。在分子水平上对应抗体和抗原是如何发生这一反应机理还没有明确。并且很多方法无法影响它们之间的动力学和平衡性。在免疫测定中所改变的条件有孵育时间,抗体和抗原浓度,温度。

PCB通过机械原理来增强蛋白与蛋白结合。首先PCB采用一种类似于“过滤”的方式,这一过程能有效的使抗体和抗原结合。这一过程采用溢流法原理,但液体从多孔介质中抽出通过毛细作用原理吸收物质Millipore公司的WB系统采用似与真空压力原理能使整个WB过程从几个小时缩短到仅仅45分钟就可以完成

第二,PCB采用循环方法进一步增强结合。“过滤”在一次过程中是无法达到zui大结合,在许多实验中都存在这一点(如WB实验)抗原仅仅只有一小部分在多孔载体上,并且但抗体溶液通过多孔载体时仅仅只有一小部分抗体与抗原结合。 PCB采用循环方法使得抗体溶液可以反复透过多孔介质从而显著增强了抗体与抗原的结合。 

第三,PCB可以快速实现结合和清洗这样可以避免已形成的抗体-抗原复合物解离。在免疫检测中,抗体和抗原形成复合物后需要一直维持到实验结束然而,由于抗体和抗原的结合反应是可逆的,所以在洗涤和孵育过程中会破坏之间的平衡。即使抗体和抗原反应具有很高的平衡常数(Ka> 109 M-1)然而之间的半衰期也只有几十分钟。在免疫检测中在加入二抗反应后的洗涤是很重要的,因为在持续几小时的反应和过程中几次溶剂的更改,会促使抗体从抗原上发生解离。若使用了中等或者低特异性的抗体时就会存在这种风险。在PCB方法中,能够迅速完成洗涤和孵育过程,所以使得抗体-抗原复合物解离降到zui低。
3.蛋白质循环反应仪使用方法

 

收到蛋白循环反应仪后,请仔细检查外包装,确保在运输过程中未收到损坏。如果有损坏迹象,立即通知承运人,并提出索赔。某些运营商在交付的一定时间内,必须承担赔偿费用。

A。包装清单

打开外包装,检查内部机器及配件是否齐全(见表1)。若有遗漏物品请及时反馈。

表 1: 包装内容

项目

描述

数量

规格

1

 

蛋白质循环反应仪

1

 27cm

 22cm

 24cm

 15 kg

2

 

说明书

1

 

3

 

电源线

1

zui大电流10A

 

B。安全说明

警告

禁止在危险环境下使用赛龙循环反应仪。

警告

若有液体溢出,请立即清理,以防止电击。清理前应拔下插头,清理结束后才可继续操作机器。

警告

如果有机械损坏的迹象,则不要继续使用仪器。

 

C.使用须知

蛋白免疫印迹仪交付的所有主要组件已经组装,必须保持原有的容器和包装组件的情况下,返回原厂修理。

仪器请平放在实验台上,请勿倾斜放置或摆放在不平整的台面上。

 “电源开关”位于该装置的左侧,此开关应处于“关”位置。将电源线连上机器,插头插入三孔插座,此时机器就可以使用了。

(1)PCB
 

2)控制程序

打开仪器左侧的电源开关,即可进入以下程序控制界面,所有操作通过触摸屏控制。控制界面分为四个部分,分别是参数设置部分、状态显示部分、数值输入部分和控制键部分。
 

 参数设置

共有四个参数:运行速度,运行距离,循环次数。

a. Speed:运行速度设置是控制反应台升降的快慢,设定范围为0—10,建议设定速度为2或3。

b. Distance:运行距离设置是控制反应台升降的距离,设定范围为0—10,建议设定距离为5或6。

c. Cycles:循环次数设置是控制反应台循环的次数,反应台上下往返一次为一个循环。

 

状态显示

a. Time Stared:显示循环程序从开始运行到目前的时间。

b. Time Lapsed:显示离所有循环完成所需的时间。

c. Cycles Passed:显示当前已完成几次循环操作。

 

数值输入

 根据实验需要,点击数字输入相应的参数设定值,点击“<”可清除光标前一位的数字,点击“CE”可清除当前参数栏的所有数字。

 

控制键:

a。 Up:根据所设定的速度Speed,向上移动设定的距离Distance

b。 Down:根据所设定的速度Speed,向下移动设定的距离Distance。

c. Start:设定好三个程序参数后,点击此键开始循环程序。反应台必须位于初始位置才能使用此键。

d. Stop:暂停正在进行的循环程序,可以在任何时候暂停程序。

e. Resume:当一个操作程序开始运行后,因为某些原因您暂时停止了该操作,您可以从刚才停止的地方恢复,继续运行未完成的操作程序。

f. Reset 当机器不能进行循环反应或者机器运行期间不能进行设置,让机器回到初始状态。

 

(3)循环反应试剂盒使用安装说明
 

试剂盒尺寸:18mm×18mm×18mm

试剂盒由三个部分组成:膜介质,顶部为储液槽,底部为活塞,各部件作用如下:

●膜介质:包被抗体或抗原

储液槽:加入检测样,zui多可容纳500uL液体

活塞:滑入PCB升降台中,将试剂盒固定

a.试剂盒中包被抗体或抗原
 

包被方法:采用移液器取0.2uL-0.5uL抗体溶液或抗原溶液加在膜介质上

 

b。循环反应试剂盒在PCB上安装
 

●试剂盒的活塞部位与PCB上的升降台中的卡槽对应上,再将试剂盒滑推至卡槽中将其固定。

(4)操作流程

●开机

●设置运行参数

a。点击Speed,设置反应台升降的速度,设定范围为0—10,建议速度设置为2—3。

b.点击Distance,设置反应台升降的距离,设定范围为0—10,建议反应液体积为500ul时距离设置5或6。

c。点击Cycles,设置循环反应次数,反应台升降一次为一个循环。

●安装已包被好抗体或抗原的试剂盒

●运行程序

a. 设置以上参数后,点击Up或Down,可让反应台进行单次上升或下降(Distance的数值);

b. 点击Start,可让反应台进行已设定数量的循环;

c。 在反应台进行循环反应的过程中,出现任何问题可以点击Stop,立即暂停反应台的升降,如需继续程序可点击Resume;

d. 程序运行完成后,点击Reset,让机器回复到初始状态;

e。 循环过程的状态显示在屏幕的右上角,包括循环程序从开始运行到目前的时间、离所有循环完成所需的时间和当前已完成几次循环操作。

●取下试剂盒添加底物进行后续检测操作。

●实验结束关闭电源
4.蛋白质循环反应仪操作说明

 

A.蛋白质循环反应仪实验方法概述

PCB能够运用多种方法形式,在这些方法过程中仅仅需要几分钟就可以完成实验PCB一般方法包括固定,封闭,结合,洗涤和信号检测。在结合和洗涤步骤中,PCB可以实现自动循环多次操作。

固定

通过手动点样或者点样仪将捕获试剂(抗体或者抗原)以非公价形式固定在膜上。

封闭

固定操作结束后使用封闭液把膜其他未固定位置封闭上防止后面与分析试剂中的物质发生非特异性结合而导致结果出现的高背景等问题。封闭液一般可采用BSA,或者1-5%牛奶溶液。采用PCB技术封闭步骤只需1-2次循环就能达到较好封闭效果。

结合

分析试剂加入到PCB反应试剂盒中,通过循环10-20次分析物可以很好的结合。

洗涤

结合反应结束后,再加入洗涤溶液,这里只需几次循环就能完成洗涤步骤。这里洗涤主要是去除未结合的分析物,在整个实验过程中会有几个步骤需要洗涤,而每一步的洗涤仅仅需要循环几次就能完成。

信号检测

一般检测抗体采用酶标抗体。这些酶包括碱性磷酸酶(AP)或者是(过氧化物酶)另外采用胶体金可以直接在肉眼下观察或者采用照相机拍照。

 

B.蛋白质循环反应仪直接/间接法免疫法测定

间接法免疫测定被用来检测蛋白质样品中的抗体,检测出抗体浓度。

该方法主要含有以下步骤:

1。在试剂盒中的膜介质上固定抗原

2。加入无关联的蛋白溶液,如BSA,酪蛋白,使得膜介质上空白位点封闭上。

3.加入待测样,循环10次使得膜介质上的抗原能够充分的捕获到需检测的抗体。

4.洗涤除去未结合的抗体。

5.加入酶标的二抗,循环10次使得二抗能够与之前被抗原捕获到的抗体结合

6.洗涤除去未结合的二抗。

7。加入酶底物,使得膜介质上产生颜色或光信号,这些信号与被捕获的抗体浓度关联。
 

PCB直接法检测应用实例:CEA检测

1。在4个pcb循环反应盒内的膜介质上包被CEA抗原1ug;

2.分别向储液槽中加入500uL 1%脱脂牛奶,循环反应3次,移去封闭液,封闭结束;

3.分别向储液槽加入4个梯度的检测抗体500ul(分别含有0,20,40,80pg的CEA),循环反应10次,检测抗体反应结束; 

4.分别向储液槽中加入500ul0.01MPBST或者TBST,循环3次,洗涤结束;

5.分别向储液槽中加入500uL 1ug酶标二抗,循环反应10次,二抗结合结束;

6。分别向储液槽中加入500ul0。01MPBST或者TBST,循环3次,洗涤结束;

7。从PCB中取出试剂盒,并加入ECL底物,进行化学发光采集实验结果。
 

D。蛋白质循环反应仪三明治一步检测法

该方法类似于上述的三明治法,主要先将检测抗体与待测样混合,让检测抗体与待测样中的抗原发生特性结合后再加入到试剂盒中与捕获抗体反应

1.固定

2.封闭:加入无关联的蛋白溶液,如BSA,酪蛋白,使得膜介质上空白位点封闭上

3.混合:待测样与检测抗体混合

4.捕获:将混合有检测抗体的待测样加入到试剂盒中与捕获抗体反应

5.洗涤:除去未结合检测抗体

6。检测:加入底物检测信号
 

PCB一步法应用实例:CRP检测

1。分别在4个PCB循环反应盒内的膜介质上包被梯度的CRP捕获抗体1ug、0。5ug、0。25ug(后两排为Control点);

2.分别向储液槽中加入500uL 1%脱脂牛奶,循环反应3次,移去封闭液,封闭结束;

3。取4个梯度稀释的血清样品500ul,分别含有0pg、5pg、20pg、80pg的CRP,再向其分别加入1ug的CRP检测抗体,混合10分钟-1小时;

4.分别向反应盒中加入混合后的检测液,循环反应10次,反应结束。

5.分别向储液槽中加入500ul0.01MPBST或者TBST,循环3次,洗涤结束;

6.从PCB中取出试剂盒,并加入ECL底物,进行化学发光,采集实验结果。
 

E. 蛋白质循环反应仪竞争检测法

竞争法是采用未标记分析物与带标记分析物同时竞争捕获抗体。通过检测被捕获到的带标记的分析物计算含量理论上,样品中含有未标记的分析物越多则被捕获到的标记的分析物就越少,因此检测出被标记的分析物数量反推出待测样中分析物的含量。

竞争法方法如下:

1。固定

2.封闭:加入无关联的蛋白溶液,如BSA,酪蛋白,使得膜介质上空白位点封闭上

3.混合:把确定含量标记的分析物与待测样混合。

4.捕获:加入混合样到试剂盒中循环10次,充分让捕获抗体结合分析物。

5.洗涤:除去为结合的抗原

6。检测:加入底物检测信号
 

PCB竞争法应用实例:B1检测

1。分别在6个PCB循环反应盒内的膜介质上包被在包被AFB1抗体50ng,

2。分别向储液槽中加入500uL 1%脱脂牛奶,循环反应3次,移去封闭液,封闭结束;

3。取6个梯度的竞争标准品500ul,分别含有0ng、0。95ng、1。9ng、3。9ng、7。8ng和15。6ng的带酶标标准品抗原,分别加入200ng的检测抗原,混合均匀;

4.将混合液分别加入反应盒中,循环反应10次,反应结束;

5.分别向储液槽中加入500ul0.01MPBST或者TBST,循环3次,洗涤结束;

6.从PCB中取出试剂盒,并加入ECL底物,进行化学发光,采集实验结果;
 

F. 蛋白质循环反应仪多重检测法 

多重检测实验步骤:

1固定:在膜介质上预定的位置固定多种捕获抗体

2.封闭:加入无关联的蛋白溶液,如BSA,酪蛋白,使得膜介质上空白位点封闭上

3.捕获:加入含有多种分析物溶液,循环10次,让捕获抗体能够充分捕获到其对应的抗原

4.洗涤:除去没有结合上的抗原。

5。检测:加入底物检测信号
 

 

 

。蛋白质循环反应技

 

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