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UNcle多參數高通量蛋白質穩定性分析系統

网上买足球GENGXINSHIJIAN:2019-09-24

簡要描述:

YUJIANUncle:YIGEPINGTAI12ZHONGWENDINGXINGYINGYONGJIANCE$nUncleSHIYIGEJIANCEWENDINGXINGDEYITIHUAPINGTAI,KETONGGUOYITAIYIQISHIXIAN12ZHONGBUTONGDEYINGYONG。TACAIYONGYINGGUANG,JINGTAIGUANGSANSHE(SLS)HEDONGTAIGUANGSANSHE(DLS)DEJIANCEFANGFABIAOZHENGDANBAIZHIWENDINGXING(TU1)。 DUOZHONGJIANCEFANGFAYIWEIZHUKEYIDUITONGYIZHONGYANGPINJINXINGDUOCANSHUJIANCE,LIRURERONG,JUJIHEKELIDAXIAO。 WEILEDEDAOWANZHENGDEXINXI,XUYAOTONGSHICAIYONGGUANGSANSHEHEYINGGUANGDEJIANCEFANGFA,JISHIJUJIYANGAILEDANBAIZHIKELIDEBIANHUA,YINGGUANGYEKEYIJIAN

  1. 半數變性溫度(Tm

网上买足球TONGGUONEIYUANXINGYINGGUANGZHIJIEJIANCEDANBAIZHIDEZHANKAI,QUEDINGQIRONGJIEWENDU。SUIZHUDANBAIZHIDEZHANKAIHEANJISUANDEZHONGPAI,SEANSUANHELAOANSUANDEYINGGUANGBIANHUABIAOMINGDANBAIZHIDEGOUXIANGFASHENGBIANHUA。NEIYUANXINGYINGGUANGSHIZHIJIEGUANCHADANBAIZHIJIEZHEDIEDEFANGFAZHIYI,JISHIZAIJUJIKAISHIHOUYEKEYIZHEYANGJIANCE,ZHEYUJIYUGUANGSANSHEHUOLIANGREFADEFANGFABUTONG。ZHEZHONGJIANCEFANGSHIKEYIDUIGOUJIANTIDEWENDINGXINGJINXINGPAIXUHUOBIJIAOBUTONGDEPEIFANGYIHUODEJIAOYOULIDETIAOJIAN。ZAIDADUOSHUQINGKUANGXIA,SUIZHUDANBAIZHIDEZHANKAI,YINGGUANGQIANGDUHUIFASHENGBIANHUAHUOFENGZHIPIAOYI。DANZHEZHONGJIANCEFANGSHIYEYOUHENDUOLIWAI,HAODEFANGSHISHIDUISHUJUJINXINGFENXI。UncleJIANCEWANZHENGDEYINGGUANGGUANGPU,YIQUEBAOYONGYOUSUOXUDESUOYOUSHUJU,BINGYININXUYAODESUOYOUFANGSHIJINXINGFENXI。

 

网上买足球UncleTONGGUOZHIJIECELIANGNEIZAIYINGGUANGDEZHANKAILAIQUEDINGDANBAIZHIDERONGHUAWENDU。SUIZHUDANBAIZHIDEZHANKAIHEANJISUANDEZHONGPAI,SEANSUANHELAOANSUANDEYINGGUANGBIANHUABIAOMINGQIGOUXIANGYEFASHENGBIANHUA。GUYOUYINGGUANGSHIGUANCHADANBAIZHIJIEZHEDIEDEZHIJIEFANG

 

 
   

网上买足球TU1:Uncle:YIZHANSHIWENDINGXINGFENXIPINGTAI。

 

FAZHIYI,JISHIZAIJUHEKAISHIHOUYEKEYIZHEYANGZUO,ZHEYUJIYUGUANGSANSHEHUOLIANGREFADEFANGFABUTONG。 ZAIDADUOSHUQINGKUANGXIA,SUIZHUDANBAIZHIZHANKAI,YINGGUANGQIANGDUFASHENGBIANHUAHUOFENGZHIPIAOYI。 DANYEYOULIWAIDESHIHOU,HAODEFANGFASHIDUISHUJUJINXINGXITONGXINGFENXI。UncleCELIANGWANZHENGDEYINGGUANGGUANGPU,YIQUEBAOYONGYOUXUYAODESUOYOUSHUJU,BINGYININXUYAODEFANGSHIJINXINGFENXI。

 

2.聚集起始溫度(Tagg)

TONGGUOZAILIANGGEBUTONGBOCHANGXIASHIYONGSLSTONGSHIJIANCEXIAOKELIHEDAKELI,LEJIEDANBAIZHIZAIRESHENGWENGUOCHENGZHONGRUHEYIJIHESHIJUJI,KEYIDUININDEGOUJIANTIHUOZHIJIJINXINGPAIXU,ZHAODAOFANGZHIHUOYANCHIJUJIKAISHIDEFULIAO。 YOUYUDANBAIZHIKEYIZHANKAIYEKEYIJUJI,YINCITONGSHIJIANCETmHETaggKEYIFANGBIANQUEDINGDANBAIHESHIZHANKAI,YIJIDAOZHIJUJIDEYUANYIN。 SHIYONGBUYILAIKELIDAXIAOBIANHUADEYINGGUANGFANGFA,JISHIZAIJUJIYIJINGKAISHIZHIHOUYEKEYICELIANGTm。

 

 

       
       
 

网上买足球 TU2:LIANGZHONGBUTONGZHIJIPEIFANGZHONGKANGTIDERERONG(A)HEREJUJI(B)QUXIAN。     

 

 

Tm和Tagg組合檢測方法:以多種制劑制備濃度為0.5mg / mL的單克隆抗體。將每種樣品9μL加載到Uni管中,并以15-95℃的熱升溫運行,升溫速率為0.3℃/分鐘。選擇熒光強度的BCM模型作為佳分析方法。

 

Tm結果:在制劑1中,抗體經歷三個不同的轉變,由軟件確定發生在57.8℃,71.5℃和88.1℃(圖2A)。因為蛋白質直到后來才展開,相同抗體在制劑2中顯示出熱穩定性的改善, 該條件下Tm為73.6℃。

 

Tagg結果:网上买足球在蛋白質一次構像展開之后,266nm處的SLS(圖2B)顯示制劑1中的抗體在67℃下突然發生聚集。在大約78℃時,266nm處的信號強度達到最大值并且聚集的蛋白質開始沉淀。相反,制劑2中的相同抗體在整個熱升溫過程中幾乎不顯示聚集。此結果與SLS在473nm處(未示出)檢測的結果相似。雖然蛋白質在67°C開始聚集,但在較高溫度下,Tm2和Tm3仍可通過內源熒光檢測到。

 

  1. 用SYPRO熒光染料檢測半數變性溫度

差示掃描熒光測定法(DSF)是確定熔融溫度的經典高通量方法之一。蛋白質可與外在染料如SYPRO®Orange結合使用,當它與未折疊蛋白質的疏水表面結合時,會發生熱變換。 該應用可用于蛋白質中很少或沒有色氨酸殘基的情況,或評估濃度非常低的蛋白質穩定性的情況。 與Uncle上的其他所有應用程序一樣,該軟件簡化了數據分析,以節省時間。

 

方法:用SYPRO®Orange配制1 mg / mL的人單克隆抗體。 將9μL樣品加載到Uni管中并以15℃至95℃的熱升溫運行,升溫速率為0.5℃/分鐘,激發波長為473nm。 Uncle分析軟件使用510-680nm之間的曲線下的面積來計算曲線的拐點并分析數據。

 

結果:通過軟件計算抗體在62.5℃和76.3℃下構象發生改變(圖3)。 當蛋白質折疊時,來自SYPRO®网上买足球染料被緩沖液的水性環境淬滅,熒光信號的強度很低。 當蛋白質在較高溫度下展開時,隨著疏水區域的暴露,信號顯著增加,然后在變性蛋白質的解離和聚集后再次降低。

 
   

TU3:SHIYONGSYPRO®OrangeYINGGUANGRANLIAOJIANCEKANGTIDERERONGJIE。

 

4.△G(吉布斯自由能變)

网上买足球QIANGZHIJIANGJIESHISHIWENWENDINGXINGPINGGUDEJIDINGTIDAIPIN,DANRESHENGWENFANGFABINGBUZONGNENGQUFENXIANGSIWENDINGXINGDETIAOJIAN。 DUIYUZHEXIEJISHOUDEWENTI,ΔGZHIKETIGONGDANBAIZHIWENDINGXINGDEDINGLIANGJIANCE,TAKEZAIZHENGJIAOYINGLITIAOJIANXIACELIANG。 TONGGUOJIANGDANBAIZHIBAOLUYUHUAXUEBIANXINGJIZHONGBINGCELIANGQISUOCHANSHENGDEYINGGUANGBIANHUA,KEYIJISUANDANBAIGOUXIANGZHANKAISUOXUDENENGLIANG。

 

方法:网上买足球制備含2至9.2M尿素的32個點的變性曲線,其中治療性抗體的終濃度為864μg/ mL。 將樣品在室溫孵育過夜,確保反應達到平衡。取9μL樣品分別加到Unis管中,并在25℃檢測。

 

結果:圖4顯示抗體在350/330nm處的熒光比值與變性劑濃度的函數關系。蛋白質在變性劑濃度4.6M和6.3M下經歷兩種不同的構象改變。Uncle分析軟件使用3-state模型擬合數據,計算在兩種構象改變條件下的ΔG值分別為9.89kcal/mol和10.9kcal/ mol。 在室溫下反應達到平衡時,首次次構象發生改變的變性蛋白質為0.06ppm,樣品第二次發生構象改變時變性蛋白質為0.01ppm。

 

  1. 等溫穩定性

DENGWENWENDINGXINGSHIWENDINGXINGPINGGUDELINGYIZHONGFANGFA。BUSHIJIANGWENDUSHENGGAOYIYINQIRONGHUAZHUANBIAN,ERSHIJIANGYANGPINZAILVEDIYUYUQITmDEWENDUXIABAOCHIGENGCHANGSHIJIAN。 JIANGYANGPINMIFENGZAIUniBISEGUANZHONG,WENDUKEBAOCHISHUXIAOSHIHUOSHUTIANERBUHUIZHENGFA。XUANZEZAIYINGGUANGHESLSMOSHIXIATONGSHIJIANCEYANGPINDEGOUXIANGZHANKAIHEJUJI,RUGUOXIANGLEJIEFENZIHUOJUJITIDEDAXIAORUHESUISHIJIANBIANHUA,QINGXUANZEDLS。

 

方法:以PBS(制劑A)和增加不同濃度精氨酸的PBS溶液(制劑B-E)配制終濃度1mg/mL的人抗體。 將每種樣品9μL加載到Uni管中并在60℃下孵育36小時,該溫度低于抗體的解鏈溫度。

 

結果:圖5顯示在266nm處的光散射強度。隨著精氨酸濃度的增加,聚集減少,在更長的孵育時間里,差異的幅度更明顯。

 
   

网上买足球TU4:ZHILIAOXINGKANGTIDEBIANXINGQUXIAN。TONGGUOUncle RUANJIANCAIYONG3-stateMOXINGJISUANBIAOZHONGDESHUZHI

 
   

TU5:ZAIWUZHONGBUTONGZHIJIPEIFANGZHONGKANGTIDEDENGWENJUJI。

 

6.熱變性恢復

网上买足球REBIANXINGHUIFUKEYIJIANCEDANBAIGOUXIANGZHANKAIDEKENIXING,HUOJIANCEWENDUBIANHUARUHEYINGXIANGFENZI。XUANZEYIGEWENDU(HUOJIGE),BINGSHANGXIASHENGGAO,GUANCHADANBAIZHISHIFOUKEYIZAIXUANZEDEZHIJIZHONGZHONGXINZHEDIE。XUANZEYINGGUANG,SLSMOSHITONGSHIJIANCEDANBAIGOUXIANGZHANKAI,ZHONGZHEDIEHEJUJI。RUGUOXIANGJIANCEDANBAIZHIDEGOUXIANGSUIZHULIUTIDONGLIXUELIJINGDAXIAOHESHIJIANDEGAIBIAN,KEXUANZESHOUJIDLSSHUJU。

 

方法:网上买足球用PBS緩沖液制備終濃度5mg/mL的人抗體。將9μL樣品加載到Uni管中,并在15°C至58°C的溫度下運行三次溫度升溫,每個溫度保持20分鐘,然后在15°C至70°C溫度下進行三次溫度升溫,每個溫度保持20分鐘。

 

結果:网上买足球該圖顯示了通過在熒光信號的BCM模型下測量蛋白質的解折疊和重折疊,以及473nm處的光散射強度(圖6)。當蛋白質升溫至低于其Tm的溫度時,看到的少量構象展開是部分可逆的,并且不會導致任何聚集體形成。然而,當溫度升高至70℃時,較大的顆粒不可逆地形成,即使樣品冷卻至15℃,熒光信號仍然很高。

 

7.粒度與多分散性系數

DLSSHIYIZHONGGAOLINGMINDUDEGONGJU,YONGYUCELIANGRONGYEZHONGDANBAIZHIHEXIAOFENZIDELIUTIDONGLIXUELIJINGDAXIAO。 UncleDELINGMINDUFUHEXINGYEGAOBIAOZHUN,KEYIZAIDIZHI0.05mg/mLDENONGDUXIAJIANCEDANBAIZHIDEDAXIAO。 SHIYONGDLSKEYISHIBIEJUJITIHUOZAZHIDECUNZAI,BINGQUERENFENZISHIFOUSHIQIWANGDEDAXIAO。LINGWAI,KEYI15-95°CZHIJIANDERENHEWENDUXIAHUODELIJINGXINXI。

DUOFENSANXINGSHIYANGPINBUJUNYUNXINGDEHENGLIANGBIAOZHUN,RUGUOKELICHICUNBUJUNYUN,JIANGJIANCEDAOJIAOGAODEDUOFENSANXINGZHI。 DIDUOFENSANXINGZHIBIAOMINGKELICHICUNGENGJUNYUN。UncleZAIJIANCELIJINGDETONGSHIBUSHIYONGRENHEEWAIDEDANBAIZHIHUOTIANJIARENHESHIJIAN,JIKEHUODEYOUGUANDUOFENSANXINGDEGENGDUOXINXI,BINGKEZAIXIANGTONGYANGPINSHANGJINXINGQITASHIYAN。

 

方法:网上买足球將9μL 0.5mg/mL的單克隆抗體加載到Uni管中,并在62℃保持16小時,每10分鐘測量4次DLS數據,每次5秒。 在開始(t = 0)和結束(t = 16小時)時樣品的尺寸分布顯示在圖中(圖7)。

 

結果:在運行開始時,抗體在預期大小處有一個峰,并且多分散性值低于0.1,表明為單分散性樣品。 在62℃孵育16小時后,在該制劑的Tm或Tagg溫度以下,存在兩個不同(較大)的峰,并且多分散性已增加至高于0.5,表明聚集體有顯著的增加。

 

8.升溫粒度

QUEDINGHUOQUERENSHENGWUZHIJIREWENDINGXINGDELINGYIZHONGFANGFASHIYONGDLSCELIANGDANBAIZHIDELIUTIDONGLIXUELIJINGDAXIAO,YINWEIDANBAILIJINGZAIREYINGJIXIAHUIJINGLIGOUXIANGBIANHUA。TONGGUODLSCELIANGLIJINGDEZENGJIASHIDANBAIGOUXIANGZHANKAIDEZHENGJU。RANER,ZAIJUJIKAISHIHOU,JINYONGGUANGSANSHEBUNENGQUEDINGZHENZHENGDERONGRONGWENDU。 UncleDEDUOZHONGJIANCEMOSHIKEGENGQINGXIDILEJIEDANBAIZHIGOUXIANGDEZHANKAIHEJUJI,CONGERKEKAODIJIANCEDANBAIZHIDEGOUXIANGBIANHUA。

 

方法:將9μL0.5mg/ mL的單克隆抗體加載到Uni管中,并以40-74℃的熱升溫運行,升溫速率為0.3℃/分鐘。每次檢測都進行兩次DLS信號采集,每次采集3秒。

 

結果:溫度在70℃之前,總體平均粒徑和散射光強度保持恒定;溫度在70℃左右,兩種檢測值均顯著增加(圖8)。這與該制劑中抗體的第二次構象展開相對應。

 
   

TU6:DANBAIZHIZAILIULUNJIAREHELENGQUEHOUDEREBIANXINGHUIFU。

 
   

 

 

9.kD:(擴散相互作用系數)

Uncle能確定蛋白質在不同配方中的擴散相互作用系數,以幫助預測其膠體穩定性或聚集的可能性。在結構和制劑配方縮小到更小范圍后,使用這種非侵入式技術可以驗證優化后的條件。另外,只需一次實驗和幾分鐘的時間即可以同時獲得B22值。

 

方法:配制不同pH,不同緩沖液(乙酸鈉,組氨酸或磷酸鹽)終濃度15mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)。通過光吸收檢測蛋白確切的濃度,并且在每個pH條件下進行6次稀釋,直至2mg / mL。將每種樣品取9μL加載到Uni管中,每個樣品三次重復。采集4次DLS數據,每次5秒。 Uncle分析軟件使用每個樣品測量的流體動力學粒徑,結合制劑信息,計算擴散系數。通過擬合直線的斜率和截距來計算kD值。

 

結果:強陽性的kD值(如該蛋白質在pH7條件下所見)表明蛋白凈排斥相互作用(圖9)。 kD值隨pH降低而降低。在pH 4時,負kD网上买足球值表明蛋白之間的凈吸引相互作用。這與之前在這些條件下對BSA的檢測結果*。

 

       
       
 

10.B22:(第二維里系數)

第二維里系數是研究樣品中蛋白質分子之間相互作用的既定且有價值的方法。在測量kD的同時,使用完全相同的樣本,即可獲得獨立計算的B22測量結果,通過它幫助預測蛋白質在制劑配方中的聚集傾向。正B22网上买足球值表示蛋白質分子之間的凈排斥力,而負B22值表明蛋白質易于自我結合。

 

方法:在Uni管中測量甲苯散射強度,以校準儀器的標準參數。配制不同pH,不同緩沖液(乙酸鈉,組氨酸或磷酸鹽)終濃度15mg / mL的牛血清白蛋白(BSA)。通過光吸收檢測蛋白確切的濃度,并在每個pH條件下進行6次稀釋,直至2mg / mL。將每種樣品取9μL加載到Uni管中,每個樣品三次重復。采集4次DLS數據,每次5秒。 Uncle軟件使用每個樣本的光散射強度來計算Kc/R值,通過數據擬合線的斜率計算B22

 

結果:強陽性的B22值(如在該蛋白質的pH7條件下所見)表明凈排斥相互作用,這與相同條件下獨立測量的kD值*(圖10)。同樣地,在pH4時,負B22值表明分子之間有相互吸引的作用,因此該條件不是該蛋白質的有利制劑。

 

11.G22 : (Kirkwood-Buff Integral)

G22是一種更嚴格的檢測蛋白質的凈自身相互作用參數的方法,特別是在高濃度時,G22可以確定樣品中的蛋白質-溶劑和蛋白質-溶質相互作用。與B22不同,陰性G22值表示蛋白質分子之間的凈排斥力,而陽性G22表示可能的自結合。這節省寶貴的樣本和時間,可以對B22數據重新分析,以獲得在蛋白高濃度時的G22值。

 

方法:在Uni管中測量甲苯散射強度,以校準儀器的標準參數。在pH5的40mM乙酸鈉緩沖液(含或不含300M NaCl)中制備80mg / mL的α-胰凝乳蛋白酶原。通過光吸收測量蛋白濃度,并6次稀釋蛋白至20mg / mL。將每種樣品取9μL加載到Uni管中,每個樣品三次重復。采集4次DLS數據,每次5秒。Uncle軟件使用每個樣品的光散射強度來計算R90/K值,其與蛋白質的預期分子量一起使用計算不同條件下蛋白質的G22值。

 
   

圖11:在pH 5的條件下,蛋白質濃度與散射強度的函數關系,以及蛋白質高濃度(80mg / mL)時的G22值。

 

結果:R90/K的強烈上升趨勢(如該蛋白質在300M NaCl制劑中的條件所示)表明凈吸引相互作用,這與在相同條件下高蛋白質濃度時計算的陽性G22值*。不含NaCl的蛋白質制劑在高蛋白質濃度時顯示出R90/K的適度增加以及負G22网上买足球值,表明該蛋白質在此條件下不具有自結合的傾向。

 

 

  1. 黏度

网上买足球UncleKEYIBIJIAOBUTONGDANBAIZHIDENIANDU,BINGZAIZHIJIKAIFAGUOCHENGZHONGGENGZAODILEJIEPEIFANGCHENGFENHUOFUXINGJIRUHEZENGJIAHUOJIANGDIRONGYEDENIANDU。UncleXUYAODEYANGPINLIANGBICHUANTONGDEZHANDUJIXIAO,YINCIKEYIYONGGENGSHAODEDANBAIZHISHAIXUANGENGDUODETIAOJIAN。

 

方法:网上买足球對于甘油標準品,將1μL的100nm聚苯乙烯微珠和1μL的吐溫溶液分別與100μL10種不同濃度的甘油溶液(0至67%(w/w))混合。對于蛋白質樣品,以PBS為緩沖液制備濃度范圍為1-300mg/mL的BSA溶液,并將每種樣品與100nm聚苯乙烯微珠和稀釋后的吐溫混合,不含蛋白質的樣品用于標準微珠粒徑檢測。將每種樣品取9μL加載到Uni管中,并在23℃進行4次數據檢測,每次5秒。對于甘油標準品,用PBS替代微珠樣品,將數據與在Rheosense microVISC上收集的黏度測量值相關聯。

 

甘油結果:使用Uncle和粘度計測定的甘油溶液黏度結果之間存在極好的相關性(圖11A),黏度高達14cP。對于每種儀器,將三次讀數取平均值以獲得圖表上的值,但是每次測量時Uncle僅需要9μL樣品,而粘度計需要400μL樣品。

 

蛋白質結果:用Uncle測量濃度高達300mg/mL的BSA溶液的黏度,黏度值高達4cP,且具有重復性(圖11B)。對于這種牛頓流體的黏度值與之前報道的通過其他方法獲得的值相符。

 

       
       
 

 

TU12:ZAIUncleHEZHANDUJI(A)SHANGCELIANGDEGANYOUBIAOZHUNPINNIANDUZHIDEXIANGGUANXING,YIJIYOUUncle(B)CELIANGDEDANBAIZHINONGDUZENGJIASHIDENIANDUZHI。

 

 

小結

Uncle結合了三種檢測方法,可在單一平臺上實現更穩定的測量。通過組合各檢測方法,為研究人員提供了更大的靈活性; 例如,可以通過熱熔融和聚集跟蹤粒徑和多分散性系數。 在某些情況下,可以同時獲得兩組值(例如kD和B22)。總之,使用一臺儀器可以完成12種不同的應用,大大降低了蛋白質樣品的體積要求,而且避免需要使用幾種單一測量儀器來確定穩定性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

       
       
 

 

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